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上海恒遠教您如何用ELISA方法檢測ABA的含量
點擊次數:777 發布時間:2017-05-09

    Elisa試驗是一種敏感性高,特異性強,重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩定、易保存,操作簡便,結果判斷較客觀等因素,已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中,在今天的文章中,將為大家介紹如何用ELISA方法去檢測ABA的含量!

    先將ABA蛋白質復合物與固相載體(聚苯乙烯微量滴定板)結合,然后將待測的ABA(樣品或標準品)和兔抗ABA抗體加入微量滴定板的孔中,進行競爭反應,接著棄去上清液,洗滌固相表面,加入酶標二抗使其與結合在固相ABA上的抗體反應,zui后去除多余的未反應的酶標二抗,測定與固相結合的酶活性,酶活性和待測ABA含量呈負函數關系,即固相ABA結合的抗體與酶標二抗量(OD或B%)隨待測ABA含量增加而減少,以一系列已知濃度的ABA的OD值制圖而獲得標準競爭性抑制曲線,對于未知樣品B,只要在同樣條件下測定反應后的OD值,就可以從標準曲線上查到ABA的量。

測定方法 
1.包被:在微量滴定板內準確加入100μLABA包被液,37℃濕盒過夜。 
2.標樣稀釋?:取8支試管每管加150μLDB,*管中加入50μL(2000ng/50μL)標準液,充分渦旋后,取50μL至第二號管中,同樣渦旋后,取50μL到第三管;依次稀釋到第六管,稀釋后的標準ABA依次為1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng/50μL。 
3. 洗板:從37℃濕盒中取出滴定板,恢復到室溫后,棄去包被液,用WB(洗滌緩沖液)洗滌三次,甩干(吸水紙)。 
4.加樣:1~8孔對應加入ABA標樣50μL,10號孔相應加入zui濃ABA標樣,9號孔加50μLDB,三排重復;然后每孔加50μL抗體,37℃ 45分鐘。 
5.洗板: 
6.加酶標二抗:每孔加100μL,37℃反應1小時。 
7.洗板: 
8.顯色:各孔加10μLOPD顯色液,37℃ 20分鐘。 
9.終止反應:各孔加50μL 6NH2SO4。 
10.讀數:490nm讀取OD值。其中10號孔調零,而9號孔為zui大值(B0),1~8號孔的OD值為B。 
11.結果計算:以In(B/B0)∕(1-B/B0)為縱坐標,以標準ABA濃度的常用對數(lg[ABA])為橫坐標,繪制曲線。 

 

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